兩名地鐵維修人員被一隻巨型蜥蜴襲擊，其中一人更被綁架。《號角日報》的報導顯示，曼克頓發生多宗神秘失蹤事件，並提及有關巨型蜥蜴的傳聞，出版商J約拿詹姆森隨後懸賞1,000美元獎金，給能夠拍到它的攝影師。記者彼得柏加想獲取獎金，以幫助梅姨償還部分巨額債務。彼得於是便去採訪研究爬蟲類的科學教授康納斯博士。期間，他和另一位理科學生Debra Whitman親眼目睹了蜥蜴人從老師廁所離開。
外號皇霸的黑幫大佬，收買奧斯本的負責人諾曼奧斯本去收拾蜘蛛俠。諾曼奧斯本聘請機械人專家Spencer Smythe，製造出蜘蛛殺手機械人來對付蜘蛛俠，並給他足夠的金錢去為兒子Alistair買張飛天輪椅。另外，《號角日報》記者艾迪布洛克為求取悅老闆J約拿詹姆森，一心想拍攝到蜘蛛俠戰敗的畫面。
皇霸向Alistair指蜘蛛俠要為他父親的死負上責任，並向他提供更多資金，以建造出更多蜘蛛殺手機械人。Alistair其後成功重建Black Widow並造出另一款更巨大的機械人，取名為the Tarantula。當這兩個蜘蛛殺手機械人抓住蜘蛛俠後，Alistair利用他將J約拿詹姆森引誘到自己的巢穴，並認為他也有份害死自己的父親。
當有一名疑似蜘蛛俠的人洗劫博物館，J約拿詹姆森引導大眾相信蜘蛛俠就是一名犯罪分子。彼得決定找尋線索，證明這些劫案是冒牌貨的所作所為，例如，冒牌蜘蛛俠的蜘蛛網和正牌的不一樣，不會在發射後一小時溶解。彼得夥拍警探Terry Lee找尋線索，他找到在犯罪現場留下來的蜘蛛網，並向Terry指出它是假的，因為蜘蛛俠的網在那時已經溶解。
彼得正要與Felicia約會，貪腐的科學家章魚博士卻將她綁走，迫使她的母親交贖金，以兌現她曾答應資助他的科學實驗。彼得回想起在10歲時，班叔叔曾帶他去科學營並見過章魚博士。當被J約拿詹姆森冒犯之後，章魚博士堅持要他交贖金，卻出爾反爾，更挾持他作為第二人質並要求雙倍贖金。交了贖金後，彼得還是無法說服章魚博士釋放他們。還是靠蜘蛛俠擊敗章魚博士並將他關進大牢。
倒霉透頂的小混混Mac Gargan受J約拿詹姆森所聘用去收拾蜘蛛俠，隨後他便被帶到Farley Stillwell博士的實驗室，並被人改造成超級壞蛋蠍子人，這是因為蝎子就是蜘蛛的天敵。蜘蛛俠遇上蠍子人後便陷入苦戰。然而，當詹姆森命令蠍子人揭開蜘蛛俠的面具時，Gargan終於醒覺到這個出版商人已把他變成了一隻怪物。他不斷異變，更開始越來越無人性。一怒之下，他綁架了詹姆森。
彼得柏加約了科學家Mariah Crawford面試。當彼得來到她的辦公室時，竟發現她正被獵人克雷文襲擊。蜘蛛俠出手救走Crawford博士後，她解釋，原來她和克雷文曾經相愛，但有次他被獅子襲擊身受重傷，別無選擇之下只好給他吃一粒由舊同事留低的神藥。這種神藥能治好所有傷口，但服用後卻會發展出像動物一樣的感官和能力，令人性情大變。蜘蛛俠以為Robbie出了遠門，便將Crawford博士送到他的住所。想不到Robbie提早回來，更被克雷文誤當成情敵，並綁架了他。
太空人約翰詹姆森和Paul Stevens發現了一塊名為「鉕X」的岩石，但他們並不知道，鉕X含有一種神秘元素能破石而出，並嘗試吞噬他們。太空穿梭機墜落在哈德遜河附近的曼克頓大橋上，此時犀牛奉皇霸之命前來偷取鉕X。蜘蛛俠趕到現場，成功拯救詹姆森和他的同事。然而，當彼得睡覺時，這種神秘物質滲入他的體內，令他發噩夢…當他醒來後，發現自己正吊在一棟大樓上，而身上所穿的竟是從未見過的服裝！
蜘蛛俠注意到自己的行為出現了令人憂慮的變化，於是向康納斯博士求助。博士研究黑色戰衣後，發現它是一個共生體。蜘蛛俠隨後利用共生體的能力，在艾迪的住所找到線索，卻意外遇上震動人，他奉皇霸之命前來毀滅 Brock在墜機現場留下的證據。蜘蛛俠記起早前被Sonic Blaster攻擊時，共生體曾變得異常虛弱，因而發現它對巨大噪音特別敏感。於是，蜘蛛俠利用教堂的鐘聲令共生體變得虛弱，成功令它從身上脫落，當場敗走。
蜘蛛俠換回舊戰衣後，隨即遇上犀牛和震動人。雖然蜘蛛俠能夠輕鬆擊敗犀牛人，但對抗震動人時卻處於下風。此時，一位不知名的「盟友」登場，並獨力擊敗這兩名反派。原來，這位新「盟友」是化身成「毒魔」的艾迪布洛克。
外號皇霸的Wilson Fisk不斷威嚇諾曼奧斯本，於是諾曼便僱用Hobgoblin去刺殺他。正當Hobgoblin想襲擊皇霸時，彼得柏加出手相救。Hobgoblin雖然成功擺脫蜘蛛俠，但卻因刺殺失敗而被諾曼解僱了。得悉諾曼的企圖後，皇霸反過來聘請Hobgoblin來對付諾曼。為了折磨諾曼，Hobgoblin綁架了哈利並將他交給皇霸，但由於皇霸拒絕付錢，Hobgoblin只好辭職。諾曼知道後再次僱用Hobgoblin，決心擊敗皇霸。
Hobgoblin擊敗皇霸並宣布自己成為新的黑幫大佬。Fisk成功擺脫Hobgoblin後，請求諾曼奧斯本助他奪回首領之位。諾曼指自己要去營救被Hobgoblin囚禁在罪惡中心的兒子哈利，成功說服到蜘蛛俠幫助他們。蜘蛛俠一出手便擊敗Hobgoblin，成功為不醒人事的梅姨和被綁架的哈利報仇。後來，彼得知道梅姨完全康復後，彼得終於鬆一口氣。
國際特工變色龍企圖暗殺兩名外交官，以阻撓他們簽署和平協議。J約拿詹姆森協助神盾局破壞變色龍的計劃。同時，蜘蛛俠亦出手幫助神盾局局長費尼克阻止罪案發生。
